小鼠Flag标簽(Flag-tag)檢測(cè)試劑(jì)盒

小鼠Flag标簽(Flag-tag)檢測(cè)試劑(jì)盒
簡介
FLAG标簽，或FLAG八肽，或FLAG表位，是一種多肽蛋白質标簽，可以用重組DNA技術添加到蛋白質中，其序列圖案爲DYKDDDDK（其中D=天冬氨酸
，K=賴氨酸），它是最特異的标簽之一，是一種通用種屬工抗原，已經開發出特異的、高親和力的單克隆抗體，因此可用於(yú)親和層析法的蛋白質純化，也可用於(yú)定位活細胞内的蛋白質，它已被用於(yú)分離重組的、過量表達的蛋白和宿主生物體表達的野生型蛋白
，它還可用於(yú)分離具有多個亞單位的蛋白質複合物，因爲其溫和的純化過程往往不會破壞這種複合物，它已被用於(yú)獲得足夠純度和質量的蛋白質，以通過X射線晶體學進行三維結構測定
，FLAG标簽可用於(yú)許多需要抗體識别的不同檢測中，如果沒有針對某一特定蛋白的抗體
，在蛋白上添加FLAG标記，就可以用針對FLAG序列的抗體來研究該蛋白，例如通過免疫熒光、免疫沉澱或通過SDS PAGE蛋白電泳和Western印迹檢測進行細胞定位研究，從N端到C端的FLAG标簽的肽序列是，DYKDDDDK（1012Da），此外，它還可以串聯使用，常見的是3xFLAG肽，DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK（标簽編(biān)碼一個腸激酶裂解位點），它可以與蛋白質的C端或N端融合，或插入到蛋白質内，一些市售的抗體（如 M1/4E11）隻有在N端出現時才能識别該表位，然而，其他可用的抗體（如M2）則對位置不敏感，FLAG标簽中的殘基可以被硫酸化，這可能會影響抗體對FLAG表位的識别，FLAG标簽可以與其他親和力标簽一起使用，例如多标簽（His标簽）、HA标簽或myc标簽。

檢測原理

本試劑盒採用雙抗體夾心法ELISA技術:将捕獲抗體包被於(yú)酶标闆上，捕獲樣品及标準品中的待測(cè)物Flag-tag，清洗後(hòu)，再加入抗體标記的檢測(cè)抗體進行孵育後(hòu)清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測(cè)抗體"免疫複合物，随後加入鏈黴親和素偶聯的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結束後清洗，接著(zhe)加入TMB顯色後，若樣本中有待測(cè)物則顯藍色，加入終止液停止反應。檢測(cè)過程中遊離的成分均被洗去，用酶标儀在450 nm處測(cè)OD值，顔色的深淺和樣品中的待測(cè)物的含量呈正比，通過繪制标準曲線計算出樣本中Flag-tag的濃度。

操作要點

1. 混合蛋白質溶液時，應始終避免起泡。爲瞭(le)避免交叉污染，在添加每個标準品、樣品和試劑時應更換移液器槍頭。此外，每種試劑應單(dān)獨使用容器。

2. 確(què)保試劑不間斷地添加到闆孔中。爲瞭(le)確(què)保準確(què)的結果，在孵育步驟中需要粘合好封闆膜。

3. 當使用自動洗闆機時，在加入洗滌緩沖(chōng)液後加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間将闆旋轉180度，可以提高測(cè)定精度
。

4. 顯色劑應保持無色，直到添加到闆中。確(què)保顯色劑不受光線照射。顯色劑應從無色變(biàn)爲藍色。

5. 應按照與顯色劑相同的順序将終止液添加到闆中。加入終止液後，孔中形成的顔色将從(cóng)藍色變(biàn)爲黃色。綠色的孔表示終止液未與基質溶液充分混合。

需要的其他材料

1. 酶标儀，包含450nm測(cè)定波長(zhǎng)，同時包含600-680nm校正波長(zhǎng)更佳；

2. 移液器及槍頭；

3. 蒸餾水或去離子水；

4. 100-1000 mL刻度量筒；

5. 洗瓶、排槍或自動(dòng)微孔闆清洗機(jī)；

6. 水平軌道微孔闆振蕩(dàng)器，能夠(gòu)保持500±50 rpm的速度；

7. 用於(yú)稀釋(shì)标準品和樣品的試管。

注意事項

1. 本試劑(jì)盒提供的終止液爲稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應謹(jǐn)慎操作。

2. 本試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚(fū)過敏反應，應佩帶(dài)口罩避免吸入薄霧。

3. 顯色劑B可能會引起皮膚(fū)、眼睛和呼吸道刺激，應佩帶(dài)口罩避免吸入薄霧。

4. 佩戴防護手套、眼睛和面部防護用品，處(chù)理後(hòu)洗手。

試劑準備

1. 使用前将所有試劑(jì)置於(yú)室溫平衡30分鍾左右
。

2. 洗滌(dí)液/稀釋液配置：如果洗滌(dí)液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱⾄晶體全部溶解
。用蒸餾(liú)水1: 20稀釋（例如：1mL濃縮洗滌(dí)液加入19mL的蒸餾(liú)水）

标準品配置

試劑(jì)盒中取出标準品，準備(bèi)7個試管，先從160ng/mL标準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至8ng/mL（例：50μL的标準品母液+950μL的1×稀釋液，制備(bèi)得到1000μL的8ng/mL濃度标準品），随後在6個試管中分别加入500μL的1×稀釋液，在這6個單(dān)獨的試管中将8ng/mL标準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的标準品，依次爲:  8ng/mL、 4ng/mL、 2ng/mL、 1ng/mL、 0.5ng/mL、 0.25ng/mL、 0.125ng/mL，從高濃度标準品溶液中吸取500μL标準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行标準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度标準品(0ng/mL)。

結果的計算

計(jì)算标準品和樣本複(fù)孔的平均OD值並(bìng)減去空白孔的OD值作爲校正值。以濃度爲橫坐标，OD值爲縱坐标，在坐标紙上繪出四參數邏輯函數的标準曲線（作圖時去掉空白組的值）或者使用能夠生成四參數邏輯（4-P）曲線拟合的計算機軟件來創建标準曲線。若樣品OD值高於(yú)标準曲線上限，應适當稀釋後重測並(bìng)在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。

小鼠Flag标簽(Flag-tag)檢測(cè)試劑(jì)盒
示例數據

以下數據(jù)和曲線僅供參(cān)考，實驗者需根據(jù)自己的實驗數據(jù)建立标準曲線。

本圖所示标準曲線僅供示例，結果計(jì)算應以同次試驗标準品所繪(huì)标準曲線爲準計(jì)算樣本結果
靈敏度

經樣本測(cè)試，本試劑(jì)盒的檢測(cè)靈敏度爲0.06ng/mL。

特異性

該試劑盒測定可識别重組小鼠Flag-tag。

其他相關蛋白在稀釋緩沖(chōng)液中制備(bèi)爲50ng/mL，並(bìng)測(cè)定交叉反應性。沒有觀察到明顯的交叉反應。

實驗步驟彙總
1. 加标準品及樣(yàng)品，37℃避光反應1.5h，洗滌(dí)3次。

2. 加檢測抗體，37℃避光反應(yīng)1h，洗滌(dí)4次。

3. 加酶結合物，37℃避光反應(yīng)30分鍾，洗滌(dí)4次。

4. 加顯(xiǎn)色液，37℃避光反應(yīng)15分鍾。

5. 加終止液，在5分鍾内讀(dú)數(shù)。

小鼠Flag标簽ELISA檢測試劑盒用於(yú)定量檢測(cè)細胞培養上清、血清、血漿中小鼠的Flag-tag使用本産(chǎn)品之前，必須完整閱讀(dú)本說明書，小鼠ELISA試劑盒僅供科研使用，不能於(yú)其它診斷(duàn)。